高速冷凍離心機提取植物蛋白質方法

　　高速冷凍離心機提取植物蛋白質方法

　　一、植物組織蛋白質提取方法

　　1、根據樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液，可根據材料不同適當加入)，準備提取液放在冰上。

　　2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時)。

　　3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

　　4、提取上清液，樣品制備完成。

　　蛋白質提取液：300ml

　　1、1Mtris-HCl(PH8)45ml

　　2、甘油(Glycerol)75ml

　　3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

　　這種方法針對SDS-PAGE，垂直板電泳!

　　二、植物組織蛋白質提取方法

　　氯醋酸—丙酮沉淀法

　　1、在液氮中研磨葉片

　　2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后離心(4℃8000rpm以上1小時)棄上清。

　　3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇)，搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時)，然后真空干燥沉淀，備用。

　　4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心(15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準)，可臨時保存在4℃待用。

　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃備用。

　　藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

　　這種方法針對雙向電泳，雜質少，離子濃度小的特點!當然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會減少!

　　三、組織：腸黏膜

　　目的：WESTERNBLOT檢測凋亡相關蛋白的表達

　　應用TRIPURE提取蛋白質步驟：

　　含蛋白質上清液中加入異丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

　　倒轉混勻，置室溫10min

　　離心：12000g，10min，4度，棄上清

　　加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)

　　振蕩，置室溫20min

　　離心：7500g，5min，4度，棄上清

　　重復0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次

　　沉淀中加入100%乙醇2ml

　　充分振蕩混勻，置室溫20min

　　離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀

　　1%SDS溶解沉淀

　　離心：10000g，10min，4度

　　取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)

　　存在的問題：加入1%SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結晶?測濃度，含量才1mg/ml左右。

　　解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5-10分鐘，效果很好的。

　　四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根

　　1、200毫克樣品置于冰上磨碎

　　2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清

　　3、重復離心5min

　　lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40

　　五、蛋白質樣品制備

　　秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進行。

　　100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇)，混勻，-20℃沉淀1小時，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時，同上離心棄上清，(有必要再用80%丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。

　　按每mg干粉加入20μl(可調)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動幾次，28度(溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結冰)16000r/min離心15min，離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存

　　六、植物根中蛋白質的抽取

　　(1)sample,液氮研磨

　　(2)裝1.5mlcentrifuge用tube

　　(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul

　　(4)12000rpm,4度,10-15minite

　　(5)取上層液，蛋白質就在里面